Diana Frances Spencer hay thường được gọi tắt là Diana, sinh ngày 1 tháng 7 năm 1961, tại Park House, Sandringham, Norfolk, vương quốc Anh. Bà là con thứ tư trong số năm người con của Tử tước xứ Althorp, John Spencer (1924-1992), và người vợ đầu của ông Frances (1936–2004). Gia tộc Spencer vốn có mối quan hệ đồng minh bền chặt với vương thất Anh qua vài thế hệ. Cả hai người bà của Diana đều phục vụ như là vai trò phụ tá riêng cho Nữ vương Elizabeth II, vị trí chỉ dành cho các quý tộc cao quý. Gia đình Spencer hi vọng mẹ Diana sẽ sinh một bé trai để kế thừa huyết thống dòng họ, và đã không có cái tên được chọn trong tuần đầu tiên, cho đến khi họ chọn tên Diana Frances, được đặt theo tên của mẹ bà và Lady Diana Spencer, Bà Công tước xứ Bedford - chị của ông cố nhiều đời trước của bà. Lady Diana Spencer cũng từng được hứa hôn với Frederick, Thân vương xứ Wales vào trước những năm 1730 nhưng không thành vì Thủ tướng Anh đương nhiệm muốn Thân vương xứ Wales kết hôn với Công chúa từ các vương thất châu Âu khác.[3][3][4]

Vào ngày 30 tháng 8 năm 1961, Diana làm lễ rửa tội tại nhà thờ St.Mary Magdalene Church, Sandringham. Bà lớn lên cùng ba người chị em ruột: Sarah, Jane, và Charles. Anh trai của bà, John Spencer, đã mất sau khi sinh một năm trước khi Diana được sinh ra. Nỗi khao khát với một người con trai thừa kế làm tăng căng thẳng trong cuộc hôn nhân của gia đình Spencers, mẹ Diana được cho rằng đã được đưa tới các phòng khám ở London để xác định nguyên nhân của vấn đề. Điều này được miêu tả là "nỗi xấu hổ" đối với em trai của Diana, Charles Spencer: "Đó là một khoảng thời gian khủng khiếp đối với cha mẹ tôi và có lẽ là gốc rễ của việc ly dị bởi vì tôi không nghĩ họ đã vượt qua nó. Diana lớn lên ở Park House, nằm trên mảnh đất Sandringham. Gia đinh Spencer thuê căn nhà từ Nữ vương Elizabeth II. Vương thất thường xuyên đi nghỉ tại xung quanh Sandringham House, và Diana đã chơi với Vương tử Andrew và Vương tử Edward khi còn nhỏ.[3][3]

Diana được 7 tuổi khi cha mẹ bà ly dị[5], mẹ bà sau này bắt đầu một mối quan hệ với ông Peter Shand Kydd và kết hôn vào năm 1969.[6] Diana sống với mẹ ở London trong lúc cha mẹ ly thân, nhưng trong mùa lễ Giáng sinh Tử tước Althorp (cha của Diana) không cho phép Diana trở về London với mẹ. Sau đó, với sự giúp đỡ của mẹ vợ cũ là bà Ruth Roche, Bà Nam tước Fermoy, Tử tước John Spencer được quyền nuôi nấng Diana.[3]Vào năm 1976, John Spencer kết hôn với Raine McCorquodale, trước đây là Bà Tử tước Dartmouth, con gái duy nhất của Alexander McCorquodale và bà Barbara Cartland.[7] Mối quan hệ của Diana với mẹ kế đặc biệt tồi tệ.[6] Bà không ưa Raine, người mà bà gọi là "Bully", và đã có lần Diana xô Raine ngã từ trên cầu thang xuống. Diana bắt đầu được xem là "Lady Diana Spencer" khi cha bà thừa kế tước vị Bá tước Spencer vào ngày 9 tháng 6 năm 1975.[8]. Sau khi học xong trường Institut Alpin Videmanette tại Thụy Sĩ, Lady Diana dọn về London, và làm công việc giữ trẻ tại Young England School.[3][3][9]